ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ МЕТОДА ВЕСТЕРН-БЛОТ ПРОВОДЯТ ОБРАБОТКУ (ГИБРИДИЗАЦИЮ) ИССЛЕДУЕМОГО ПРЕПАРАТА
1) низкомолекулярными красителями
2) пептидами
3) антителами (+)
4) липидами

Правильный ответ: 3) антителами (+). Детекция в вестерн-блоте основана на специфическом иммунном распознавании: после переноса белков на мембрану блокируют неспецифические участки и инкубируют с первичными антителами к целевому белку. Для усиления сигнала применяют мечёные вторичные антитела (обычно с пероксидазой хрена, щёлочной фосфатазой или флуорофорами), что позволяет получить хемилюминесцентный, колориметрический или флуоресцентный сигнал.

Низкомолекулярные красители, пептиды и липиды сами по себе не обеспечивают необходимой специфичности к мишени; красители (например, Ponceau S) используют лишь как быстрый контроль переноса всех белков, а не для адресной детекции конкретного белка.

Этап/узел	Реагент/материал	Назначение	Типичные примеры	Ключевые параметры/советы
Перенос	Мембрана	Фиксация белков после электрофореза	PVDF, нитроцеллюлоза	PVDF активируют в метаноле; избегайте пересушивания нитроцеллюлозы
Контроль переноса	Общий краситель	Визуализация всех белков	Ponceau S, Coomassie	Кратковременно окрашивать и полностью отмывать перед иммунодетекцией
Блокирование	Блокирующий буфер	Снижение неспецифического связывания	5% обезжиренное молоко, 3% BSA, казеин	Выбирайте BSA при фосфо-мишенях; избегайте молока для биотин-систем
Первичная инкубация	Первичные антитела	Специфическое распознавание мишени	Моноклональные/поликлональные IgG	Оптимизируйте разведение и время/температуру (обычно 1:500–1:5000; 4 °C на ночь)
Вторичная инкубация	Вторичные антитела (мечёные)	Усиление сигнала и визуализация	Анти-IgG-HRP, анти-IgG-AP, флуорофоры (Alexa Fluor)	Подбирайте по виду-донорам первичных антител; избегайте перекрёстной реактивности
Детекция (хемилюмин.)	Субстрат для HRP/AP	Излучение света при ферментной реакции	ECL-субстраты для HRP, CSPD для AP	Выбирайте чувствительность ECL под ожидаемую экспрессию; избегайте пересвета
Детекция (флуоресц.)	Флуоресцентные метки	Мультиплексирование и количественная оценка	Alexa 488/555/647 и др.	Проверяйте спектральное перекрытие; используйте соответствующие фильтры
Детекция (колорим.)	Хромогенные субстраты	Образование окрашенного осадка	DAB, TMB, BCIP/NBT	Менее чувствительна, но проста и стабильна; подходит для быстрой верификации
Промывки	Буфер с детергентом	Удаление несвязанных белков/антител	TBST (TBS + 0,05–0,1% Tween-20)	Достаточная длительность и кратность промывок критичны для снижения фона
Нормализация	Домашние белки / общая окраска	Сравнение загрузки дорожек	β-актин, GAPDH, тотальная окраска (Total Protein)	Предпочтительна тотальная окраска для количественной точности
Типичные ошибки	—	Высокий фон/слабый сигнал	Слишком концентрированные антитела, недостаточные промывки, неправильный блок	Оптимизируйте разведения, увеличьте промывки, смените блокирующий агент